前列腺癌（PCa）是男性中最常見的惡性腫瘤，它的發(fā)生和發(fā)展與雄激素受體（AR）信號(hào)密切相關(guān)。雄激素剝奪療法（ADT）一直是局部晚期和轉(zhuǎn)移性腫瘤患者的主要治療方法。然而，盡管使用第二代抗雄激素藥物治療，如苯扎魯胺（ENZ）和阿比特龍，最初會(huì)限制腫瘤，大多數(shù)患者最終復(fù)發(fā)為轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗PCa（mCRPC）。

越來越多的證據(jù)表明，腫瘤微環(huán)境（TME）與 去勢(shì)抵抗性前列腺癌（CRPC）有關(guān)，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）是腫瘤基質(zhì)中最豐富的細(xì)胞類型之一，呈現(xiàn)異質(zhì)性與表型可塑性，在體外，iCAF（炎癥成纖維細(xì)胞）、myCAF（肌成纖維細(xì)胞） 和 apCAF （抗原呈遞類成纖維細(xì)胞）會(huì)根據(jù)培養(yǎng)條件進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化。然而，目前還不清楚CAFs 命運(yùn)轉(zhuǎn)換和表型轉(zhuǎn)換是如何與疾病復(fù)發(fā)有關(guān)的。

烈冰生物合作伙伴中國(guó)科學(xué)院上海營(yíng)養(yǎng)與健康研究所秦駿課題組聯(lián)合中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院黃海以及中國(guó)人民解放軍陸軍特色醫(yī)學(xué)中心大坪醫(yī)院江軍團(tuán)隊(duì)針對(duì)上述問題開展了系列研究，于近期在 Cancer Cell期刊發(fā)表了題為：Antiandrogen treatment induces stromal cell reprogramming to promote castration resistance in prostate cancer 的研究論文。烈冰生物參與了本研究中的單細(xì)胞測(cè)序和數(shù)據(jù)分析工作，下面我們一起了解一下本文的研究思路和結(jié)果解析部分～

發(fā)表日期：2023年5月

發(fā)表期刊：Cancer cell

影響因子：IF=50.3

“單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)”

實(shí)驗(yàn)分組：

Pten基因敲除小鼠（無治療），4月齡；惰性前列腺腫瘤

Pten; Trp53雙基因敲除小鼠（無治療），3.5月齡；轉(zhuǎn)移性前列腺腫瘤

Pten基因敲除小鼠（2.5月齡去勢(shì)隨后2個(gè)月的ENZ治療）；對(duì)ADT部分敏感

Pten; Trp53雙敲除小鼠（2.5月齡去勢(shì)隨后2個(gè)月的ENZ治療）；去勢(shì)抵抗性前列腺腫瘤（CRPC）

采樣組織：小鼠前列腺

單細(xì)胞捕獲平臺(tái)：10X Genomics

主要技術(shù)手段：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序（scRNA-seq）、基因工程小鼠模型（GEMM）、小鼠造模（PDX）、 Bulk RNA-seq 、ChIP-seq 、ATAC-seq等

Novelbrain云平臺(tái)分析工具：

細(xì)胞聚類分析、subcluster分析、擬時(shí)序分析、差異基因表達(dá)分析、轉(zhuǎn)錄因子分析（SCENIC）、GSEA基因富集分析

【研究成果解析】

1 單細(xì)胞測(cè)序初步分析與細(xì)胞類型確認(rèn)

研究者利用基因工程編輯小鼠，通過scRNA-seq來評(píng)估免疫、腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞的群體。為了保證后續(xù)分析的可靠性，研究者與烈冰的生信團(tuán)隊(duì)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)控，最終每個(gè)樣本平均得到6960個(gè)細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞平均檢測(cè)到2039個(gè)基因。通過細(xì)胞聚類分析，總共鑒定出11 個(gè)細(xì)胞大類。其中不同樣本中細(xì)胞類型的比例有明顯差異，表明了不同疾病階段的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。

非免疫細(xì)胞（CD45-）中，Pten; Trp53雙敲除小鼠（ADT治療，即CRPC組）中發(fā)生了上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞-1數(shù)目的減少以及成纖維細(xì)胞-2數(shù)目的增加；免疫細(xì)胞群體（CD45+）中，Pten; Trp53雙敲除小鼠（ADT治療，即CRPC組）發(fā)生了中性粒細(xì)胞數(shù)量減少，并有單核細(xì)胞增多的趨勢(shì)，T 細(xì)胞組成的變化與小鼠前列腺的疾病狀態(tài)沒有明顯的相關(guān)性，支持小鼠PCa中的免疫抑制TME。

2 成纖維細(xì)胞重聚類鑒定出一個(gè)獨(dú)特的myCAF亞群

考慮到成纖維細(xì)胞的組成在Pten; Trp53雙敲除小鼠（ADT治療）中發(fā)生了較大的改變，研究者將成纖維細(xì)胞群體重聚類，得到5個(gè)亞群（c1-c5）。c1 和 c2 CAF類似于炎癥iCAF的特征、而c5 CAF 表現(xiàn)出肌成纖維細(xì)胞樣 CAF (myCAF) 的特征，c3 和 c4 呈現(xiàn)iCAF 和 myCAF 中間態(tài)的轉(zhuǎn)錄組特征，其中，c4和c5特異性出現(xiàn)在 Pten; Trp53雙敲除小鼠（ADT治療）組內(nèi)，且c5群體特異表達(dá)Ptn。進(jìn)一步的擬時(shí)序分析表明c4 和c5 CAF 源自c1-3 CAF。

使用Marker基因Col1a1，Ptn，Pdgfra區(qū)分CAF亞群，免疫熒光染色結(jié)果表明，c1-2和c4-5在使用ADT治療和非治療組中，占比存在顯著差異，PDXs造模實(shí)驗(yàn)中也驗(yàn)證了此結(jié)果，其中PDGFRα^- PTN⁺ COL1A1⁺ 代表的c4和c5 CAFs約占耐藥腫瘤中總CAFs的30%。

基于細(xì)胞分離、流式分選（FACS）、對(duì)分離CAFs的bulk-RNA測(cè)序、細(xì)胞共培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)證明，與單獨(dú)接種或聯(lián)合接種c1-3 CAFs的PCa細(xì)胞相比，只有c5 CAFs對(duì)ADT顯著不敏感，因此作者將 c5 CAFs 命名為 CRPC-CAFs，而 c1-3 CAF 在后續(xù)研究中被稱為對(duì)照CAFs（C-CAFs）。

磁共振成像（MRI）分析顯示，CRPC-CAFs缺失導(dǎo)致的前列腺腫瘤平均體積減少約2-3倍，結(jié)果支持了CRPC-CAFs是導(dǎo)致CRPC的關(guān)鍵基質(zhì)成分。

3 CRPC相關(guān)的SPP1+ myCAFs通過旁分泌激活ERK信號(hào)來抵抗ADT

為了明確CRPC-CAFs作用于PCa細(xì)胞的機(jī)制，作者進(jìn)行差異表達(dá)基因聚類，分成6個(gè)cluster。有趣的是，Cluster3的基因在與CRPC-CAFs共培養(yǎng)時(shí)相對(duì)于C-CAFs明顯升高，通路分析表明Cluster3富集了參與MAPK-ERK（細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶）信號(hào)傳導(dǎo)的基因，基因集變異分析（GSVA）進(jìn)一步證明了這一點(diǎn)。根據(jù)scRNA-seq數(shù)據(jù)篩選到了CRPC-CAFs特異的分泌因子Spp1，結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明去除分泌的磷蛋白1（Spp1）完全消除了CRPC-CAFs引起的抗雄激素作用，表明Spp1基因敲除表達(dá)有利于前列腺腫瘤的治療。

通過PDX-313HR和PDX-WCSCR模型實(shí)驗(yàn)方法，表明阻斷CAF衍生的SPP1會(huì)使PCa對(duì)ADT重新敏感。為了確定CRPC-CAFs的細(xì)胞起源，作者進(jìn)行了譜系追蹤實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)表明了AR直接抑制了Tgfbr1啟動(dòng)子的活性，AR被抑制后，釋放了TGF-β信號(hào)，將iCAFs轉(zhuǎn)化為SPP1+myCAFs。

4 TGF-β誘導(dǎo)的SOX4通過SWI/ SNF復(fù)合物依賴的染色質(zhì)重塑促進(jìn)CAF轉(zhuǎn)化

為了更好地理解ADT通過TGF-β信號(hào)通路形成CRPC-CAFs的機(jī)制，作者應(yīng)用scRNA-seq數(shù)據(jù)，采用SCENIC算法，尋找CAFs狀態(tài)下的差異激活轉(zhuǎn)錄因子（TFs），選擇Sox11、Sox9、Sox4、Tbx15等并評(píng)估其功能，通過基因敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Sox4 基因具有促進(jìn)胰腺癌腫瘤增大的功能，同時(shí)與ENZ和TGF-β1共處理時(shí)，Smad2在Sox4基因座啟動(dòng)子區(qū)域的占用顯著增強(qiáng)。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示轉(zhuǎn)染表達(dá)SOX4的慢病毒導(dǎo)致了轉(zhuǎn)錄組的實(shí)質(zhì)性變化使C-CAFs與CRPC-CAFs具有很強(qiáng)的相似性；此外，SOX4的上調(diào)導(dǎo)致了染色質(zhì)可及性的深刻變化，表明SOX4通過基因組機(jī)制促進(jìn)CAF極化，通過結(jié)合和表達(dá)靶點(diǎn)分析（BETA）整合mRNA-seq和SOX4 ChIP-seq，發(fā)現(xiàn)SOX4主要作為轉(zhuǎn)錄激活因子。

全文總結(jié)

研究團(tuán)隊(duì)通過基因工程編輯小鼠、PDX小鼠等模型，利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，以及大量的功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，揭示了雄激素剝奪治療（ADT）誘導(dǎo)的SPP1+ myCAFs是驅(qū)動(dòng)去勢(shì)抵抗性前列腺癌（CRPC）發(fā)展的關(guān)鍵基質(zhì)成分，并深入研究了該群CAFs的起源與作用機(jī)制。作者提出，靶向CAF極化或旁分泌機(jī)制結(jié)合已建立的內(nèi)分泌抗癌治療具有治療潛力，并有可能改善晚期PCa患者的治療結(jié)果。

本研究詳細(xì)信息參見原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2023.05.016

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